北京哪家医院白癜风较好 https://jbk.39.net/yiyuanzaixian/bjzkbdfyy/etbdf/●前言
年8月，中国水稻研究所胡培松院士团队在PlantBiotechnologyJournal期刊发表了题为“”的研究成果，依靠GC-MS顶空代谢组学的平台，研究新型BADH2等位基因生产芳香杂交水稻机理，加快了水稻品种香味研究改良进程。
中文标题：利用BADH2新等位基因生产芳香三系杂交稻
研究对象：水稻
发表期刊：PlantBiotechnologyJournal
影响因子：9.
发表时间：.08.31
发表单位：中国水稻研究所
运用生物技术：GC-MS顶空代谢组学(由鹿明生物提供技术支持)、基因编辑技术
●研究背景
香味是决定稻米烹饪和食用特性的独特和关键指标之一。甜菜碱醛脱氢2(OsBADH2)功能的丧失影响了2-乙酰-1-吡咯啉(2-ap)的生物合成，而2-乙酰-1-吡咯啉(2-ap)是香稻香气的主要来源。高品质香米的高需求和低供给直接导致了全球市场香米价格上涨。这也促使水稻育种家加快了开发新的高产香稻品种的速度，以满足消费者日益增长的香稻需求。传统育种或标记辅助育种技术用于芳香基因导入和芳香水稻基因型的选育往往费时费力，随着植物生物技术的进步，基因组编辑技术使现有香稻品种的改良和从非香稻品种中培育出香稻成为可能。
本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在粳稻宁粳1号(NJ1)和籼稻黄花展(HHZ)品种的遗传背景下，构建BADH2新等位基因。采用GC-MS顶空技术对BADH2等位基因系成熟籽粒进行性状分析。
●研究技术路线
●研究结果
1.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术-构建BADH2新等位基因
研究团队首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了携带水稻U6启动子和靶向BADH2基因第二外显子的单导RNA(sgRNA)的CRISPR/Cas9载体(图1b)。通过农杆菌介导将BADH2CRISPR/Cas9结构插入粳稻宁粳1号(NJ1)和籼稻黄华占(HHZ)中，在NJ1、HHZ遗传背景下，利用pcr筛选和Sanger测序，在T0代鉴定出5种BADH2纯合新等位基因。为了获得BADH2的非转基因新等位基因，研究团队在T1群体中跟踪分离了含有所需BADH2基因突变的T-DNA(图1d)，并经Cas9和HPT的PCR结果验证均为阴性，证实T-DNA的缺失(图1e)。
图1
BADH2新等位基因的鉴定及无t-dna植物的筛选
(a)BADH2基因的结构。利用BADH2-SF和BADH2-SR引物进行基因分型。
(b)Cas9/guideRNA(gRNA)载体的T-DNA区域结构。标记基因Hyg由CaMV35S(35S)启动子驱动，gRNA由U6启动子驱动，mpCas9由Ubi启动子驱动。磅,左边界。RB,对边界。
(c)通过T0转基因个体靶位点测序鉴定BADH2突变。PAM，原生间隔族相邻基序。
(d)tfp筛选过程示意图。
(e)利用特异性潮霉素和Cas9引物检测转基因载体框架。M,DLDNA标记物。
2.将BADH2等位基因系与野生型的农艺性状进行比较分析
研究团队通过对BADH2等位基因系和野生型植株的栽培分析其农艺性状，研究结果显示：
（1）nj1-crBADH2-1和nj1-crBADH2-2的粒长和千粒重显著增加；（2）nj1-crBADH2-1株系的粒宽显著增加，而nj1-crBADH2-2株系的粒宽没有变化(图2b和d)；
（3）nj1-crBADH2-1和nj1-crBADH2-2品系的每穗粒数和粒厚与野生型无显著差异(图2a和d)；
（4）HHZ-crbadh2-1和HHZ-crbadh2-2株系的HHZ、粒厚和千粒重显著降低(图2b-d)；2个株系的结实率和株高显著降低，有效分蘖数显著增加(图2a和d)。
图2
BADH2种质新等位基因农艺性状分析
(a)BADH2NJ1-crBADH2-1、NJ1-crBADH2-2、HHZ-crBADH2-1和HHZ-crBADH2-2新等位基因在NJ1和HHZ中的植物形态
(b)BADH2系新等位基因与野生型的粒长、粒宽比较
(c)BADH2系和野生型新等位基因的糙米
(d)农艺性状统计分析
3.感官评价+GC-MS顶空技术分析BADH2等位基因系水稻籽粒中的2-AP相对含量
研究团队结合感官评价、GC-MS顶空代谢组学技术，对成熟籽粒中香味物质及2-AP进行定量分析，结果表明，4个剔除转基因成分的T1纯合BADH2等位基因系(nj1-crBADH2-1,nj1-crBADH2-2，hhz-crBADH2-1和hhz-crBADH2-2)的香气适中，2-AP含量显著增加。成熟籽粒挥发物质GC-MS顶空分析数据也证实，2-AP是BADH2等位基因系与对应野生型中差异最显著的挥发物质（图3、图4）
图3
BADH2系新等位基因的芳香鉴定
(a)BADH2系和对照新等位基因2-AP和TMP(内标)的总离子色谱图(TIC)
(b)BADH2系和对照新等位基因2-AP含量
(c)BADH2在NJ1、NJ1-crbadh2-1、NJ1-crbadh2-2、HHZ、HHZ-crbadh2-1和HHZ-crbadh2-2品系颖果中的相对表达量。取值为SD。*Plt;0.05;**Plt;0.01(n=3in(b,c)，双尾学生t检验，三个独立实验)
图4
HHZ背景种子中无目标挥发物的GC-MS顶空分析
(a)代谢组学中控制BADH2和HHZ的新等位基因系的总离子色谱(TIC)。
(b)从BADH2和HHZ对照种子的新等位基因系检测到的不同挥发分的图形表示。
(c)BADH2和HHZ对照新等位基因系的火山图挥发性代谢物差异分析。
(d)种子主要挥发分差异相对含量。
4.BADH2等位基因系籽粒品质性状研究
研究团队通过对BADH2等位基因系与野生型品种籽粒品质性状的分析，发现直链淀粉含量(图5a)、凝胶稠度(图5b)、淀粉粘度(图5c)和淀粉糊化特性(图5d)均无显著变化。这些结果表明，OsBADH2的CRISPR/Cas9编辑产生了新的BADH2等位基因，在不影响其他品质性状的情况下，改善了籽粒香气。
图5
BADH2新等位基因籽粒淀粉理化性质的测定
(a)直链淀粉含量；
(b)凝胶一致性；
(c)BADH2品系NJ1、HHZ和新等位基因胚乳淀粉的糊化特性：每个温度下的粘度值是三次重复的平均值，灰色线表示测量过程中的温度变化；
(d)淀粉在尿素溶液中的糊化特性，将NJ1、HHZ和BADH2新等位基因的淀粉粉与不同浓度(19M)的尿素溶液混合。
5.杂交获得芳香型三系杂交水稻，并利用GC-MS顶空技术分析籽粒中2-AP含量
在确认了hhz-crBADH2-1和hhz-crBADH2-2等位基因可以显著提高籽粒中2-AP含量后，研究团队将2个HHZ背景BADH2新等位基因系与香型三系不育系桃农1A(TN1A)进行杂交，获得了具有较高籽粒香气的三系杂交品种B-桃优香占(BTYXZ)。利用GC-MS顶空代谢组学技术测定表明，改良的BTYXZ-1和BTYXZ-2籽粒中2-AP含量显著增加。同时该研究团队也对BTYXZ进行了全面的稻米理化性质评估、米饭质地以及食味评价，结果表明BTYXZ的胶粘度相比原品种有所增加，米饭质地变软，但综合食味评分未发生显著变化。最后，该研究团队利用高效液相色谱（HPLC）技术对改良的BTYXZ与原品种TYXZ籽粒中γ-氨基丁酸（GABA）进行测定，并分析了GABA与2-AP的相关性，为富含GABA的优质香型功能稻米研发提供了数据支撑和理论参考。
图6
BADH2新等位基因系与BTYXZ杂交种2-AP含量和农艺性状分析
图7
香味改良BTYXZ杂交种淀粉理化性质测定
图8
改良香型BTYXZ杂交种的质构和口感评价
●研究结论
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsBADH2进行定点诱变，可以成功地在水稻籽粒中创建新的BADH2等位基因，改善水稻的香气。在三系杂交稻增香育种中，新等位基因BADH2与TN1A杂交表现出良好的亲和性。此外，利用GC-MS顶空代谢组学技术在BADH2的新等位基因系和野生型的成熟种子中发现了几种不同的挥发性化合物。香气由多种复杂的挥发性化合物组成，了解它们的代谢途径是提高水稻香气产生的一个有趣的研究领域。
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文末看点｜lu
mingbio
上海鹿明生物科技有限公司多年来，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。目前鹿明生物在顶空代谢组学研究已经有了成熟的技术方法和多项项目经验
文献参考：
◆9月
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END本文系鹿明生物原创
