一旦进入指数级增长,反应会进行到PCR组分耗尽而不足以支持循环进行下去时。到这个时候,扩增产物达到最大量,而非特异性扩增几乎看不到。
含有10拷贝模板和TaqDNA聚合酶的PCR反应一般30个循环后可达到这个程度(扩增效率约0.7)。以哺乳动物基因组作为模板,扩增单拷贝序列,至少需要进行25个循环,以获得可接受的产物量。
PCR反应中可选择的成分一些助溶剂和添加剂可降低错配率及增加富含GC模板的扩增效率(吐温-20和NP-40)。助溶剂包括有机胺化合物,如甲酰胺(1.25%~10%,V/V)、二甲基亚砜(DMSO,最多可到15%,VV)(Booksteinetal.)、甘油(1%~10%,V/V)(LuandNegre)等。
添加.剂包括四甲基氯胺(Hungetal.;Chevetetal.)、甜菜碱(Henkeetal.)、谷氨酸钾(10~mmolL)、硫酸铵、非离子和阳离子去污剂,以及一些特异性强化剂,如PerfectMatch聚合酶增强子(Agilent公司产品)和GC-Melt(Clontech公司产品)。
很多这些助溶剂及添加剂在高浓度下会抑制PCR反应,因此,对每个特定的引物及模板,都需要进行试验以确定最佳浓度。
在动用这些助溶剂及添加剂之前,我们认为最好先优化PCR的常规组分,如镁离子及钾离子的浓度。